ภาระงานที่4

3.การจำลองโครงสร้างของ DNA

การจำลองตัวเองของดีเอ็นเอ (DNA replication) เป็นกระบวนการทางชีววิทยาที่เกิดขึ้นในสิ่งมีชีวิตทุกชนิดเพื่อจำลองดีเอ็นเอของตนเอง กระบวนการนี้เริ่มจากดีเอ็นเอสายเดี่ยวสร้างดีเอ็นเออีกสายที่เป็นคู่สมของตนจนกลายเป็นดีเอ็นเอเกลียวคู่ กระบวนการเป็นแบบกึ่งอนุรักษ์ (semiconservative replication) มีการตรวจสอบความถูกต้องของกระบวนการเพื่อป้องกันการกลายพันธุ์

รูปแบบการจำลองตัวเองของดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิต

แบบซีตา (Theta model) พบในสิ่งมีชีวิตที่มี DNA เป็นวงกลม เช่นแบคทีเรีย โดยช่วงหนึ่งดีเอ็นเอจะมีรูปร่างคล้าย θ การจำลองจะเริ่มที่จุดๆหนึ่งซึ่งจะโป่งออกเป็นห่วงโดยมี Replication fork อยู่ที่ปลายแต่ละด้านของจุดเริ่มต้น เกิด 2 ทิศทาง สุดท้ายจะได้ดีเอ็นเอ 2 วง

แบบซิกมา (Sigma model) ช่วงหนึ่งดีเอ็นเอมีรูปร่างคล้าย ς พบใน DNA ที่เป็นวงกลม ที่จุดเริ่มต้นจะเกิดช่องขาด ขึ้นเนื่องจากพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ถูกตัด ดีเอ็นเอสายหนึ่งยืดยาวออกไปเป็นแม่แบบ เมื่อสิ้นสุดจะได้ดีเอ็นเอเกลียวคู่เป็นวง 1 วง และเป็นเส้น 1 เส้น

แบบวาย (Y-shaped model) เป็นแบบที่พบมากที่สุด โดยจุดเริ่มต้นมีมากกว่า 1 จุด แต่ละจุดโป่งออกเป็นห่วงกระจายทั่วไป เกิด 2 ทิศทางพร้อมกัน ในที่สุดแต่ละห่วงจะมาชนกันได้ดีเอ็นเอใหม่ 2 สาย

การจำลองตัวเองของ DNA

โปรคาริโอต

รูปการจำลองตัวเองของโปรคาริโอต

การเริ่มต้น (Initiation) ในดีเอ็นเอของแบคทีเรียนั้นจะมีจุดสำหรับเริ่มจำลองดีเอ็นเอ มีโปรตีนเข้ามากระตุ้นให้ดีเอ็นเอที่จุดเริ่มต้นดังกล่าวคลายตัว เฮลิเคสเข้ามาตัดพันธะไฮโดรเจนระหว่างสายดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอบายดิงโปรตีนมาจับเพื่อป้องกันไม่ให้สร้างพันธะไฮโดรเจนต่ออีก

การสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ (Elongation) เมื่อดีเอ็นเอทั้งสองสายแยกจากกันแล้ว DNA polymerase III จะเข้ามาตรงจุดแยกเพื่อสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ เนื่องจาก DNA pol III มีคุณสมบัติในการสร้างดีเอ็นเอ
สายใหม่จาก 5’ ไป 3’ เท่านั้น ซึ่งต้องการแม่แบบที่เป็นสาย 3’ ไป 5’ แต่ดีเอ็นเอแม่แบบมีทั้งที่เป็น 3’ ไป 5’ และ
5’ ไป 3’ ดังนั้น การสร้างสายดีเอ็นเอจึงแบ่งเป็น 2 แบบดังนี้

สายต่อเนื่อง (Leading stand) คือสายที่เป็น 3’ ไป 5’ ในสายนี้ DNA polymerase III จะสร้าง
ดีเอ็นเอสายใหม่ได้อย่างต่อเนื่อง เริ่มต้นโดย Primaseสร้างไพรเมอร์ที่เป็นอาร์เอ็นเอสายสั้นๆ ขนาด 10 – 26
นิวคลีโอไทด์ เข้ามาจับกับดีเอ็นเอตรงจุดแยก จากนั้น DNA polymerase III จะเติม dNTPsเข้ามาในทิศทาง 5’ ไป 3’ ไปเรื่อยๆ

สายไม่ต่อเนื่อง (Lagging stand) เนื่องจากสายนี้ดีเอ็นเอแม่แบบเป็น 5’ ไป 3’ การสร้างดีเอ็นเอเป็น
สายยาวไปทีเดียวจึงเกิดขึ้นไม่ได้ แต่จะใช้วิธีให้สายดีเอ็นเอโค้งงอผ่าน DNA pol III เพื่อให้ DNA polymerase III สร้างดีเอ็นเอสายใหม่ในทิศทาง 5’ ไป 3’ เป็นชิ้นเล็กๆ เรียกชิ้นเล็กๆนี้ว่าชิ้นส่วนโอคาซากิ (Okazaki fragment) โดย Primaseสร้างไพรเมอร์ที่เป็นอาร์เอ็นเอสายสั้นๆ สำหรับการสร้างชิ้นส่วน
โอคาซากิแต่ละชิ้น หน่วยย่อยเบตาของ DNA polymerase III จะเข้ามาจับที่ไพรเมอร์และเชื่อมต่อกับ DNA polymerase III เมื่อหมดชิ้นจะสร้างชิ้นใหม่ หน่วยย่อยเบตาอันเดิมจะหลุดไป หน่วยย่อยเบตาอันใหม่จะเข้ามาจับกับไพรเมอร์อันต่อไป เป็นเช่นนี้ไปเรื่อยๆ

การตรวจสอบ ส่วนของไพรเมอร์ที่เป็นอาร์เอ็นเอจะถูกตรวจสอบด้วย DNA polymerase I และสร้าง
ดีเอ็นเอซ่อมแซมส่วนที่ตัดออกไป จุดขาดที่เกิดขึ้นบนสายดีเอ็นเอ เนื่องจาก DNA polymerase I
ไม่ได้ต่อพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ตรงปลาย 5’ ของจุดตัดจะถูกเชื่อมด้วย ดีเอ็นเอไลเกส โดยสายต่อเนื่องจะตัดครั้งเดียว ส่วนสายไม่ต่อเนื่องจะตัดไพรเมอร์ของชิ้นส่วนโอคาซากิทุกชิ้น

การสิ้นสุด (Termination) ระหว่างจุดเริ่มต้นแต่ละแห่งจะมีจุดสิ้นสุดของเรพลิเคชันอยู่ด้วย มีขนาด 20 คู่เบส เรียกว่า ter sequence ซึ่งจะมีโปรตีนที่จดจำตำแหน่งนี้เข้ามาจับเพื่อบอกให้ DNA polymerase III รู้ว่าจำลองดีเอ็นเอมาครบรอบแล้ว

ยูคาริโอต

รูปการจำลองตัวเองในยูคาริโอต

การจำลองตัวเองในยูคาริโอตมีความซับซ้อนกว่า โดยจุดเริ่มต้นนั้นจะมีโปรตีนที่จดจำตำแหน่งนี้โดยเฉพาะเข้ามากระตุ้นให้ดีเอ็นเอคลายตัว DNA polymerase มีหลายชนิด โดยในนิวเคลียสใช้ DNA polymerase  และ DNA polymerase  โดย DNA polymerase  ทำหน้าที่คล้าย DNA polymerase III ในโปรคาริโอต DNA polymerase  ทำหน้าที่คล้ายหน่วยเบตาของ DNA polymerase III และ DNA polymerase
ทำหน้าที่คล้าย DNA polymerase I ในโปรคาริโอต การสิ้นสุดเรพลิเคชันในยูคาริโอต เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์โครงสร้างพิเศษที่เรียกเทโลเมียร์ที่ตอนปลายของโครโมโซม

คำถาม

1.รูปแบบการจำลองตัวเองของดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิตมีอะไรบ้าง

ตอบ1.แบบซีตา (Theta model) 2.แบบซิกมา (Sigma model)

2.การจำลองของตัวเองของโปรคาริโอตคืออะไร

ตอบการเริ่มต้น (Initiation) ในดีเอ็นเอของแบคทีเรียนั้นจะมีจุดสำหรับเริ่มจำลองดีเอ็นเอ มีโปรตีนเข้ามากระตุ้นให้ดีเอ็นเอที่จุดเริ่มต้นดังกล่าวคลายตัว เฮลิเคสเข้ามาตัดพันธะไฮโดรเจนระหว่างสายดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอ
บายดิงโปรตีนมาจับเพื่อป้องกันไม่ให้สร้างพันธะไฮโดรเจนต่ออีก

3.การจำลองของตัวเองของยูคาริโอตคืออะไร

ตอบการจำลองตัวเองในยูคาริโอตมีความซับซ้อนกว่า โดยจุดเริ่มต้นนั้นจะมีโปรตีนที่จดจำตำแหน่งนี้โดยเฉพาะเข้ามากระตุ้นให้ดีเอ็นเอคลายตัว

ภาระงานที่3

2.โครงสร้าง DNA และ คุณสมบัติของ DNA

ดีเอ็นเอ (DNA) เป็นชื่อย่อของสารพันธุกรรม ที่มีชื่อวิทยาศาสตร์ว่า กรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (Deoxyribonucleic acid) ซึ่งเป็นกรดนิวคลีอิก (กรดที่พบในใจกลางของเซลล์ทุกชนิด) ที่พบในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตทุกชนิด ได้แก่ คน, สัตว์, พืช, เชื้อรา, แบคทีเรีย, ไวรัส เป็นต้น ดีเอ็นเอบรรจุข้อมูลทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตชนิดนั้นไว้ ซึ่งมีลักษณะที่ผสมผสานมาจากสิ่งมีชีวิตรุ่นก่อน ซึ่งก็คือ พ่อและแม่ และสามารถถ่ายทอดไปยังสิ่งมีชีวิตรุ่นถัดไป ซึ่งก็คือ ลูกหลาน

ดีเอ็นเอมีรูปร่างเป็นเกลียวคู่ คล้ายบันไดลิงที่บิดตัว ขาของบันไดแต่ละข้างก็คือการเรียงตัวของนิวคลีโอไทด์ (Nucleotide) นิวคลีโอไทด์เป็นโมเลกุลที่ประกอบด้วยน้ำตาล, ฟอสเฟต (ซึ่งประกอบด้วย ฟอสฟอรัส และ ออกซิเจน), และเบส (หรือด่าง) นิวคลีโอไทด์มีอยู่สี่ชนิด ได้แก่ อะดีนีน (adenine, A), ไทมีน (thymine, T), ไซโตซีน (cytosine, C), และกัวนีน (guanine, G) ขาของบันไดสองข้างหรือนิวคลีโอไทด์ถูกเชื่อมด้วยเบส โดยที่ A จะเชื่อมกับ T และ C จะเชื่อมกับ G เท่านั้น (ในกรณีของดีเอ็นเอ) และข้อมูลทางพันธุกรรมในสิ่งมีชีวิตชนิดต่างๆ เกิดขึ้นจากการเรียงลำดับของเบสในดีเอ็นเอนั่นเอง

ผู้ค้นพบดีเอ็นเอ คือ ฟรีดิช มีสเชอร์ ในปี พ.ศ. 2412 (ค.ศ. 1869) แต่ไม่ทราบว่ามีโครงสร้างอย่างไร จนในปี พ.ศ. 2496 (ค.ศ. 1953) เจมส์ ดี. วัตสัน และ ฟรานซิส คริก เป็นผู้ไขความลับโครงสร้างของดีเอ็นเอ และนั่นนับเป็นจุดเริ่มต้นของยุคเทคโนโลยีทางดีเอ็นเอ

โครงสร้างของ ดี เอน เอ

การศึกษาโครงสร้างของ ดี เอน เอ มีรากฐานมาจากการศึกษาของนักวิทยาศาสตร์หลายกลุ่ม เริ่มตั้งแต่งานของ Chargaff แห่งมหาวิทยาลัยโคลัมเบีย ซึ่งได้ศึกษาองค์ประกอบเบสของ ดี เอน เอ จากแหล่งต่างๆ แล้วสรุปเป็นกฎของ Chargaff ดังนี้

1. องค์ประกอบเบสของ DNA จากสิ่งมีชีวิตต่างชนิดจะแตกต่างกัน

2. องค์ประกอบเบสของ DNA จากสิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกันจะเหมือนกัน แม้ว่าจะนำมาจากเนื้อเยื่อต่างกันก็ตาม

3. องค์ประกอบเบสของ DNA ในสิ่งมีชีวิตชนิดหนึ่งมีความคงที่ ไม่แปรผันตามอายุ อาหาร หรือสิ่งแวดล้อม

4. ใน DNA ไม่ว่าจะนำมาจากแหล่งใดก็ตาม จะพบ A=T , C=G หรือ purine = pyrimidine เสมอ

นักวิทยาศาสตร์อีกกลุ่ม ได้แก่ Flanklinและ Wilkins แห่งมหาวิทยาลัยลอนดอน ได้ศึกษาโครงสร้างของโมเลกุลของ ดี เอน เอ โดยใช้ภาพถ่ายการหักเหรังสีเอกซ์ที่ฉายผ่านโมเลกุล
(X-rays diffraction)

ผลงานจากทั้งสองแหล่งนี้ทำให้ Watson และ Crick ค้นพบลักษณะโครงสร้างทุติยภูมิของ ดี เอน เอ ว่ามีลักษณะดังนี้

ดี เอน เอ มีรูปร่างเป็นแท่งเกลียวเวียนขวา (alpha-helix) ประกอบขึ้นจากโพลีดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์สองสาย เชื่อมกันด้วยพันธะไฮโดรเจนที่เกิดระหว่างเบสไนโตรเจนของแต่ละสาย โพลีดีออกซีไรโบนิคลีโอไทด์ทั้งสองสายนี้ จะทอดตัวกลับหัวกลับหางกัน (antiparalle) สายหนึ่งทอดตัวในทิศ 5′ - 3′ อีกสายหนึ่งจะทอดตัวในทิศ 3′ -5′ ในการเข้าคู่กันนี้ทั้งสองสายจะหันส่วนที่เป็นน้ำตาลและฟอสเฟตออกข้างนอก แล้วฝังส่วนที่เป็นเบสไว้ภายในแกนกลางโมเลกุล ทำให้ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางของแท่งเกลียว ดี เอน เอ มีขนาด 20 Å

๑ รอบเกลียวมีขนาด 34 Å ประกอบขึ้นจากจำนวนคู่เบส ๑๐ คู่ ดังนั้นแต่ละคู่เบสจะอยู่ห่างกัน 3.4 Å และการบิดรอบเกลียวทำให้โมเลกุลของ ดี เอน เอ เกิดร่องเกลียวสองขนาด ขนาดใหญ่เรียกว่า major groove ขนาดเล็กเรียกว่า minor groove

การจับกันด้วยพันธะไฮโดรเจนของคู่เบสนั้น เป็นการเข้าคู่ที่จำเพาะ คือ C จะจับกับ G ด้วยพันธะไฮโดรเจน ๓ พันธะ และ A จับกับ T ด้วยพันธะไฮโดรเจน ๒ พันธะ

รูปการจับคู่เบส

การจับคู่เบสอย่างจำเพาะมีประโยชน์คือ เมื่อเราทราบการเรียงลำดับเบสของโพลีดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ สายหนึ่งแล้ว ก็จะรู้การเรียงลำดับเบสของโพลีดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ในสายที่เข้าคู่กันด้วย เรียกลำดับนิวคลีโอไทด์ที่สามารถเข้าคู่กันได้นี้ว่า complementary base sequence

คุณสมบัติของ ดี เอน เอ

ความเป็นกรด ในสิ่งแวดล้อมปกติของเซลล์ ดี เอน เอ มีประจุเป็นลบ แสดงถึงคุณสมบัติการเป็นกรด ดี เอน เอ จึงสามารถจับกับไอออนหรือสารอื่นที่มีประจุบวกได้

การเสียสภาพของ ดี เอน เอ คำว่าการเสียสภาพ (denaturation) ของ ดี เอน เอ หมายถึงการทำให้ ดี เอน เอ ซึ่งเคยเป็นสายคู่แยกตัวออกมาเป็นสายเดี่ยว สิ่งที่ทำให้เกิดการเสียสภาพธรรมชาติของ ดี เอน เอ ได้แก่ ความร้อน กรด ด่าง รังสีเอกซ์ ยูเรีย ดี เอน เอ ที่เสียสภาพธรรมชาติไปแล้ว ถ้าปรับสิ่งแวดล้อมใหม่ให้เหมาะสม มันสามารถคืนสภาพธรรมชาติได้ใหม่ ตัวอย่างเช่น ในเทคนิค hybridization เขาจะทำให้ ดี เอน เอ เสียสภาพธรรมชาติด้วยความร้อนก่อน แล้วให้คืนสภาพธรรมชาติใหม่ด้วยการค่อยๆลดอุณหภูมิลง

การดูดกลืนแสง ด้วยคุณสมบัติของเบส ที่สามารถดูดกลืนแสงได้มากที่สุดที่ 260 nm ดี เอน เอ ก็ดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นนี้ได้ดีที่สุดเช่นกัน คุณสมบัตินี้ทำให้เราสามารถวัดหาปริมาณ ดี เอน เอ ด้วยการวัดการดูดกลืนแสง แต่สิ่งที่ต้องคำนึงในที่นี้คือ ดี เอน เอ ในปริมาณที่เท่ากัน ถ้าเป็นสายเดี่ยว (จากการทำให้เสียสภาพธรรมชาติ) จะดูดกลืนแสงได้มากกว่า ดี เอน เอ สายคู่ คุณสมบัตินี้เรียกว่า ไฮเพอร์โครมิซึม (hyperchromism)

การเสียสภาพธรรมชาติของ ดี เอน เอ และไฮเพอร์โครมิซึมมีความสัมพันธ์กัน เช่นเมื่อเพิ่มอุณหภูมิให้แก่สารละลาย ดี เอน เอ บริเวณที่เป็น A-T rich region ซึ่งจับกันด้วยพันธะไฮโดรเจนน้อยกว่า G-C rich region จะเริ่มคลายเกลียวออก หากยังเพิ่มอุณหภูมิให้แก่สารละลาย ดี เอน เอ ต่อไป ในที่สุด ดี เอน เอ จะคลายเกลียวออกจนเป็นเส้นเดี่ยวทั้งหมด

ในขณะที่เกิดการคลายตัวของ ดี เอน เอ นั้น หากเราวัดค่าการดูดกลืนคลื่นแสงที่ 260 nm ไปด้วย จะพบว่าสารละลาย ดี เอน เอ มีการดูดกลืนคลื่นแสงมากขึ้นตามปรากฎการณ์ไฮเพอร์โครมิซึม ซึ่งหากเขียนกราฟความสัมพันธ์ระหว่างอุณหภูมิ กับการดูดกลืนแสงที่ 260 nm จะได้กราฟที่เรียกว่า DNA melting curve ค่า tm ขึ้นกับปริมาณ G-C ใน ดี เอน เอ โดยที่ ดี เอน เอ ที่มี G-C สูง จะมีค่า tm สูงกว่า ดี เอน เอ ที่มี G-C ต่ำ

ดีเอ็นเอประกอบน้ำตาลดีออกซีไรโบส (deoxyribose) ยึดจับกับหมู่ฟอสเฟต (-PO4) และเบสชนิดใดชนิดหนึ่งใน 4 ชนิด คือ แอดินีน (adenine : A) กวานีน (guanine: G) ซึ่งเป็นเบสชนิด พิวรีน (purine) ไซโทซีน (cytosine: C ) และ ไทมีน (thymine: T) ที่เป็นเบสชนิดไพริมิดีน (pyrimidine)

เมื่อเบสชนิดพิวรีนจับกับไพริมิดีน (แอดินีน จับกับ ไทมีน และ กัวนีน จับกับไซโทซีน) ที่อยู่ต่างสายพอลินิวคลีโอไทด์ด้วยพันธะไฮโดรเจนทำให้เกิดลักษณะโครงสร้างของพอลินิวคลีโอไทด์ 2 สายที่บิดเป็นเกลียว (double helix) เวียนขวา ซึ่งเป็นโครงสร้างของดีเอ็นเอ

คำถาม

1.ดีเอ็นเอ (DNA) เป็นชื่อย่อของสารพันธุกรรม ที่มีชื่อวิทยาศาสตร์ว่าอะไร
ตอบกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (Deoxyribonucleic acid)

2.ดีเอ็นเอมีรูปร่างเป็นอย่างไร
ตอบดีเอ็นเอมีรูปร่างเป็นเกลียวคู่ คล้ายบันไดลิงที่บิดตัว ขาของบันไดแต่ละข้างก็คือการเรียงตัวของนิวคลีโอไทด์ (Nucleotide) นิวคลีโอไทด์

3.การจับกันด้วยพันธะไฮโดรเจนของคู่เบสนั้น เป็นการเข้าคู่ที่จำเพาะอะไรกับอะไร
ตอบคือ C จะจับกับ G ด้วยพันธะไฮโดรเจน ๓ พันธะ และ A จับกับ T ด้วยพันธะไฮโดรเจน ๒ พันธะ